Biophotonique

Microscopie à fluorescence

La microscopie de fluorescence utilise le même principe que la microscopie optique, mais au lieu d'observer l'absorption, la diffusion ou la réflexion de la lumière, on analyse la fluorescence d'un échantillon. Ainsi, un échantillon fluorescent est excité par une lumière d'une longueur d'onde spécifique et subit une transition vers un état excité. Pendant la relaxation, l'échantillon émet une lumière d'une longueur d'onde spécifique qui est séparée de la lumière d'excitation par des filtres colorés et détectée. Dans le cadre de la microscopie à fluorescence, différentes méthodes et configurations peuvent être utilisées en fonction de l'application et de l'échantillon. Les échantillons peuvent ainsi être intrinsèquement fluorescents comme les colorants ou les semi-conducteurs, alors que la plupart des échantillons utilisent des colorants qui se lient à la structure d'intérêt. Ainsi, avec différents colorants dans un échantillon, différentes structures peuvent être colorées et visualisées différemment. Cela fait de la microscopie à fluorescence une technique supérieure pour les échantillons biologiques, car ils présentent souvent des structures qui ne sont pas visibles au microscope optique. Les applications de la microscopie à fluorescence peuvent être très différentes, elles vont de la recherche fondamentale à la science des matériaux en passant par la biologie et la pharmacie.

Les méthodes de microscopie par fluorescence les plus courantes sont présentées ci-après et les composants correspondants sont disponibles dans les catégories de produits.




Microscopie confocale

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La résolution de la microscopie à fluorescence est déterminée par la taille du spot qui, en général, est limitée par la limite de diffraction selon Ernst Abbe à environ la moitié de la longueur d'onde de la lumière utilisée.

Cependant, ceci n'est pas vrai, surtout pour les échantillons épais. L'une des raisons en est la fluorescence secondaire qui est émise à travers le volume excité de l'échantillon. La fluorescence secondaire peut obscurcir les caractéristiques de l'échantillon dans le plan focal, en particulier pour les échantillons plus épais (par exemple, les échantillons biologiques) ; beaucoup de détails sont perdus dans le processus d'imagerie.

Contrairement à la microscopie à fluorescence courante, un microscope confocal à balayage laser (CLSM) n'éclaire qu'une petite zone de l'échantillon et utilise en outre un trou d'épingle pour éliminer la lumière de la zone non focalisée. Les images sont générées en balayant l'échantillon avec une grande précision à l'aide de DeepL translations. L'utilisation d'un sténopé permet de contrôler la profondeur de champ et améliore le contraste et la définition des images acquises. Le CLSM est donc supérieur aux autres techniques en raison de la faible fluorescence de fond et d'un meilleur rapport signal/bruit. En outre, en acquérant plusieurs images 2D à différentes profondeurs dans l'échantillon, la CLSM peut être utilisée pour recréer des structures 3D. Les avantages de la CLSM sont évidents, l'élimination de la lumière hors foyer permet d'obtenir des images de haute qualité et de scanner en trois dimensions. Le CLSM présente néanmoins quelques inconvénients. En raison du processus de balayage de chaque image, la détection est plutôt lente. De plus, une grande partie de l'intensité du signal est bloquée par le sténopé, ce qui nécessite de longs temps d'exposition. Néanmoins, la microscopie confocale est une technique puissante et populaire parmi les applications scientifiques et industrielles pour la biologie, les semi-conducteurs et la science des matériaux.




Microscopie multiphotonique

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La microscopie multiphotonique est une sous-catégorie de la microscopie à fluorescence dont le principe est le même (voir figure a). Dans la microscopie de fluorescence traditionnelle, la longueur d'onde d'excitation est plus courte que la longueur d'onde d'émission. La raison en est la différence énergétique entre l'état fondamental et l'état excité du système observé. L'énergie du photon doit être au moins égale à cette différence ou plus pour exciter le système. Ensuite, l'état excité se désintègre et un photon ayant une énergie similaire à l'écart énergétique est émis. Dans le cas de la microscopie à deux photons, la lumière d'excitation a une longueur d'onde plus grande que la lumière émise. Pour surmonter l'écart énergétique jusqu'à l'état excité, l'absorption simultanée de deux photons est nécessaire. L'absorption à deux photons est un processus optique non linéaire puisqu'elle est proportionnelle au carré de l'intensité lumineuse.


Les composants de base d'un microscope à deux photons sont comparables à ceux d'un microscope à fluorescence : source lumineuse, filtre d'excitation, lentille de focalisation ou objectif, miroir dichroïque, filtre d'émission et détecteur (voir figure a). Cependant, la source de lumière est généralement un laser pulsé femtoseconde afin de garantir des flux de pointe élevés pour le processus d'absorption à deux photons. Les sources d'excitation à deux photons les plus courantes utilisent des longueurs d'onde comprises entre 700 et 1200 nm. La probabilité d'une absorption à deux photons est plutôt faible ; par conséquent, une intensité laser élevée est nécessaire, et l'excitation adéquate ne peut se produire qu'au point focal du faisceau laser, ce qui se traduit par un degré élevé de résolution car aucune zone hors foyer n'est excitée.

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La lumière d'excitation à grande longueur d'onde présente d'autres avantages. Le plus important est sans doute la profondeur de pénétration de la lumière IR dans la matière organique. Alors que la lumière visible a une profondeur de pénétration de 50-80 µm, la lumière IR peut atteindre jusqu'à 1000 µm dans des systèmes idéaux. Cela permet l'imagerie de tissus vivants, ce qui permet des recherches approfondies dans les neurosciences, la recherche sur le cancer et d'autres domaines physiologiques. Un autre avantage est la réduction du signal de fond dû à l'excitation localisée et la réduction de l'effet du photoblanchiment. En appliquant des paramètres de balayage tridimensionnel, il est possible d'acquérir des images 3D à haute résolution. Cependant, il ne faut pas négliger les inconvénients de l'utilisation de l'excitation à deux photons. Des intensités laser très élevées peuvent induire des réactions secondaires et une dégradation de l'échantillon.

La microscopie à deux, mais aussi à trois photons peut être utilisée. Comme son nom l'indique, trois photons doivent être absorbés en même temps pour exciter un échantillon et induire une fluorescence. La longueur d'onde utilisée ici est généralement de 1200 nm ou plus. Cela augmente encore la profondeur de pénétration de la lumière et permet une excitation en profondeur dans la matière organique. Récemment, des scientifiques ont été en mesure d'imager le fonctionnement du cerveau à travers un crâne de souris intact en utilisant la microscopie à trois photons.




Microscopie par feuille de lumière


Une autre technique de microscopie par fluorescence souvent privilégiée par les biologistes est la microscopie à feuillets lumineux. Contrairement aux autres méthodes de microscopie par fluorescence, l'échantillon est éclairé perpendiculairement au trajet de détection. De plus, au lieu d'un point laser focalisé, on utilise un faisceau laser lamellaire, appelé feuille de lumière. Une nappe lumineuse est générée soit en focalisant la lumière dans une seule direction à l'aide d'une lentille cylindrique, soit en balayant rapidement un faisceau laser dans une direction, créant ainsi une nappe lumineuse virtuelle. La zone de l'échantillon dans la feuille de lumière est excitée et l'émission résultante est détectée perpendiculairement à la feuille de lumière par un objectif et dirigée vers un dispositif d'imagerie. Il est ainsi possible d'immerger les voies d'excitation et d'émission dans le tampon de l'échantillon. Cela permet un contrôle supplémentaire des conditions environnementales de l'échantillon pendant l'expérience.

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L'avantage de la microscopie à feuille de lumière est que seul le volume de l'échantillon dans le plan focal de l'objectif de détection est excité. Cela réduit considérablement le signal de fond puisqu'il n'y a pas de lumière hors foyer et augmente la résolution spatiale du processus d'imagerie. De plus, le photodommage global est réduit en n'éclairant que le plan focal. En outre, le temps d'acquisition des images est beaucoup plus rapide qu'avec les microscopes à balayage ponctuel, car une image 2D complète peut être acquise en une seule fois. En balayant spatialement un échantillon, un modèle 3D peut être généré. En séparant le chemin d'excitation et d'émission dans le microscope, des combinaisons de régimes d'excitation sont possibles et permettent une imagerie multimodale.

Il existe de nombreuses extensions à la microscopie à feuilles de lumière commune, comme l'illumination avec deux feuilles de lumière pour réduire les artefacts d'ombre ou la combinaison avec la spectroscopie de corrélation de fluorescence ou des techniques à très haute résolution. En outre, la microscopie à feuilles de lumière peut être utilisée avec différentes longueurs d'onde d'excitation, permettant également l'excitation multiphotonique. Les vastes possibilités de la microscopie à feuilles de lumière en font une technique en plein essor, avec un grand potentiel pour l'avenir.

Il ne s'agit là que des principales techniques de microscopie par fluorescence, mais il existe de nombreuses extensions et variations, comme les techniques de super-haute résolution (par exemple, STED). Que vous ayez l'intention de construire vous-même un microscope ou que vous ayez simplement besoin d'un filtre supplémentaire, nous serons heureux de vous aider à construire et à faire les bons choix.

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